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Aug 23, 2023

Influencia del consumo de uva en el microbioma humano

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7706 (2023) Citar este artículo

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A lo largo de los años, se ha acumulado una gran cantidad de información que sugiere que el consumo dietético de uvas puede tener una influencia positiva en la salud humana. Aquí, investigamos el potencial de las uvas para modular el microbioma humano. La composición del microbioma, así como los metabolitos urinarios y plasmáticos, se evaluaron secuencialmente en 29 hombres sanos (de 24 a 55 años de edad) y mujeres (de 29 a 53 años de edad) que vivían libremente después de dos semanas de una dieta restringida (Día 15), dos -semanas de dieta restringida con consumo de uva (equivalente a tres raciones diarias) (Día 30), y cuatro semanas de dieta restringida sin consumo de uva (Día 60). Con base en los índices de diversidad alfa, el consumo de uva no alteró la composición general de la comunidad microbiana, excepto con el subconjunto femenino basado en el índice Chao. De manera similar, según los análisis de diversidad beta, la diversidad de especies no se alteró significativamente en los tres momentos del estudio. Sin embargo, después de 2 semanas de consumo de uva, se alteró la abundancia taxonómica (p. ej., disminución de Holdemania spp. y aumento de Streptococcus thermophiles), al igual que varios niveles de enzimas y vías KEGG. Además, se observaron cambios taxonómicos, enzimáticos y de ruta 30 días después de la terminación del consumo de uva, algunos de los cuales volvieron a la línea de base y algunos sugieren un efecto retardado del consumo de uva. Los análisis metabolómicos respaldaron la importancia funcional de estas alteraciones en las que, por ejemplo, el ácido 2'-desoxirribonico, el ácido glutacónico y el ácido 3-hidroxifenilacético se elevaron después del consumo de uva y regresaron a la línea base después del período de lavado. La variación interindividual se observó y ejemplificó mediante el análisis de un subgrupo de la población de estudio que muestra patrones únicos de distribución taxonómica durante el período de estudio. Quedan por definir las ramificaciones biológicas de esta dinámica. Sin embargo, aunque parece claro que el consumo de uva no perturba el estado eubiótico del microbioma en sujetos humanos normales y sanos, es probable que los cambios en las intrincadas redes interactivas que resultan del consumo de uva tengan un significado fisiológico relevante para la acción de la uva.

La influencia potencial del microbioma humano, que consta de más de 3 millones de genes y del orden de 1014 microorganismos1, sobre la salud y el bienestar es profunda. En las últimas dos décadas, los avances notables en la investigación del microbioma han proporcionado las herramientas y el conocimiento para permitir una investigación significativa de la influencia de este "tejido" en la salud y la enfermedad humanas (cf. 2). Palabras como prebiótico, probiótico, simbiótico, eubiosis y disbiosis ahora se incorporan comúnmente en el léxico ordinario del público en general y la comunidad científica. El mercado se ha expandido hasta convertirse en una industria multimillonaria, con un crecimiento sustancial anticipado en el futuro, a través de la provisión de productos diseñados para humanos y otros mamíferos.

Dado que en general se acepta que mantener un microbioma intestinal "saludable" es importante para la salud humana, el impacto potencial de la dieta ha sido ampliamente estudiado3. Como tal, se ha descrito la modulación de la composición del microbioma, así como los niveles de metabolitos generados por el microbioma (como acetato, propionato y butirato), por el consumo dietético de proteínas, carbohidratos, grasas, polifenoles, fitoestrógenos, etc.4.

Un área de interés para nosotros es la influencia potencial de las uvas en la salud. El consumo dietético prevalece, como lo refleja la producción de más de 6 millones de toneladas por año solo en los EE. UU. Con base en ensayos clínicos en humanos o estudios realizados con modelos animales, los resultados han sugerido una serie de respuestas mediadas por la uva sobre la aterosclerosis, la inflamación, el cáncer, la salud gastrointestinal, los efectos del SNC, la osteoartritis, la función de la vejiga urinaria y la visión5.

Recientemente, empleando modelos de ratones alimentados con uvas en la dieta, hemos demostrado efectos notables sobre la expresión génica, la prevención o el retraso del hígado graso y la mejora de la esperanza de vida6, así como efectos sobre la cognición y la expresión génica en el cerebro7. Aunque un componente químico prominente de la uva es el resveratrol, cuyo potencial biológico ha sido ampliamente investigado8, solo se proporcionan pequeñas cantidades de esta sustancia a través de una dieta humana normal. Además, se sabe que la uva contiene más de 1600 componentes fitoquímicos9, muchos de los cuales solos o en combinación pueden ser capaces de mediar una respuesta. Como tal, en el contexto de la dieta y la salud, es de gran relevancia considerar la uva como un alimento integral.

Teniendo en cuenta el amplio alcance de las acciones asociadas con el consumo de uva, nos propusimos explorar la influencia potencial en el microbioma humano como una posible base mecánica. En trabajos anteriores, el tratamiento de la microbiota intestinal humana con polifenoles totales de semillas de uva condujo a un cambio en los perfiles de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y poblaciones microbianas relevantes10. Con ratones que recibieron una dieta alta en grasas complementada con polvo de uva enriquecido, la abundancia de genes que regulan la producción microbiana de butirato aumentó selectivamente11. En nuestro trabajo murino, la excreción urinaria de los metabolitos de la microbiota intestinal ácido 4-hidroxifenilacético, 5-hidroxiindol, ácido glicérico, ácido glucónico y mioinositol se atenuó cuando se agregó uva a una dieta estándar, y la microbiota intestinal metaboliza ácido glucónico, scyllo -inositol, manitol, xilitol, 5-hidroxiindol y ácido 2′-desoxirribonico aumentaron en la orina cuando se añadió uva a una dieta rica en grasas12,13,14. Además, en un estudio de intervención humana de dos fases (fase de estandarización de 4 semanas y una fase de intervención de uva de 4 semanas), Yang et al. observaron un aumento del índice de diversidad alfa del microbioma intestinal (índice de Shannon), así como una disminución del colesterol total y de los ácidos biliares totales15.

Usando un protocolo alternativo y un mayor número de sujetos, actualmente informamos un ensayo en humanos en el que voluntarios normales de vida libre consumieron el equivalente a tres porciones de uvas por día durante dos semanas, seguido de un período de lavado de un mes. La composición resultante del microbioma intestinal se evaluó mediante análisis de heces. Además, se realizó una evaluación de metabolitos en orina y plasma.

El juicio se llevó a cabo durante un período de dos meses. Cuarenta sujetos humanos normales, sanos y de vida libre ingresaron al ensayo en el que se recolectaron secuencialmente plasma, orina y material fecal después de dos semanas de dieta restringida (Día 15), dos semanas de dieta restringida complementada con el equivalente a tres porciones de uvas por día (Día 30) y un período de lavado de un mes (Día 60). No se produjeron eventos adversos durante todo el período de estudio. Veintinueve sujetos completaron todas las fases del ensayo.

Se investigó la diversidad alfa para evaluar la riqueza (número) o la uniformidad (abundancia relativa) del microbioma de la población de estudio en los días 15, 30 y 60 (Suplemento 1). Con los 29 sujetos tomados juntos para el análisis, no se encontraron diferencias en los índices de diversidad de OTU, Chao1 o Shannon. Del mismo modo, no se observaron alteraciones con los varones incluidos en el grupo de estudio, de 24 a 44 años. Sin embargo, con mujeres en el grupo de estudio, de 29 a 39 años de edad, se observó una diferencia en el día 30 (después de dos semanas de consumo de uva) donde el tamaño del efecto d de Cohen para la prueba de Chao fue 0,836 y el valor p fue 0,114 ( prueba t de Student pareada). También se observó una diferencia al comparar la línea de base (Día 15) con el período de lavado (día 60) (d de Cohen de 0,982 y un valor de P de 0,079).

La diversidad beta evaluada por la disimilitud de Bray-Curtis se calculó y visualizó mediante análisis de componentes principales (PCA) y análisis de coordenadas principales (PCoA) (Suplemento 2). Según los análisis de conglomerados (intervalos de confianza del 95 %), no se observaron diferencias significativas en los días 15, 30 o 60 cuando la población del estudio se evaluó como un todo o se dividió en grupos compuestos solo por hombres o solo por mujeres.

Las especies microbianas encontradas en especímenes de los 29 sujetos en los días 15, 30 y 60 se muestran en la Fig. 1A. Las especies más abundantes que se encuentran en la microbiota intestinal incluyen Faecalibacterium prausnitzii, Prevotella copri, Bacteroides stercoris, Alistipes putredinis, Bifidobacterium teenageris, Eubacterium rectale, Fusicatenibacter saccharivorans, Bacteroides vulgatus, Alistipes finegoldii, Akkermansia muciniphila, Collinsella aerofaciens, Bacteroides uniformis, Bacteroides coprocola y Paraba cteroides merdae Como se puede deducir de las comparaciones de las barras triples en la Fig. 1A, cada punto de tiempo con cada individuo muestra un perfil diferente que sugiere un cambio inducido por el protocolo dietético. Se puede visualizar una descripción general de la variación individual de la diversidad de todas las especies en los días 15, 30 y 60 mediante los gráficos de área que se muestran en la Fig. 1B, y las transiciones en la composición microbiana del día 15 al 30, del día 15 al 60 y Los días 15 a 60 son evidentes a partir de las superposiciones de los gráficos de área que se muestran en el Suplemento 3, Fig. S1.

Gráficos que representan la diversidad de las especies. (A) Los diagramas apilados presentan la diversidad de todas las especies en sujetos individuales del 1 al 29. (B) Los gráficos de área muestran la diversidad de especies entre los 29 sujetos en los días 15, 30 y 60.

Los análisis taxonómicos microbianos comparativos para toda la población de sujetos para el día 15 frente al 30, el día 30 frente al 60 y el día 15 frente al 60 se presentan en las tablas 1, 2 y 3, respectivamente. Se consideró que las selecciones incluidas en las tablas eran las más influenciadas por el estado dietético en base a fuertes valores p, así como valores d de Cohen que indican un tamaño del efecto en el rango medio a grande. Se designa la jerarquía taxonómica así como una breve connotación funcional para cada entrada.

Para cada comparación, se observaron alteraciones significativas en el microbioma. En particular, después del consumo de uva (Día 30), se elevó Streptococcus thermophiles, considerado un probiótico que produce ácido láctico en el intestino. Por otro lado, Holdemania spp., se redujeron, al igual que ocurre en quienes siguen una dieta vegetariana. Curiosamente, 30 días después del consumo de uva, la abundancia de Holdemania aumentó y no se observaron cambios en Streptococcus thermophiles. Al comparar el punto de tiempo de 30 días con el punto de tiempo de 60 días, se observaron aumentos consistentes en la abundancia de organismos asociados con la producción de metabolitos como los ácidos grasos de cadena corta. Esto tiende a sugerir una respuesta tardía al consumo de uva, ya que estos cambios no se observaron en las comparaciones del Día 15 frente al 30 o el Día 15 frente al 60.

Como antes, se realizó una comparación de la abundancia enzimática asociada con el microbioma para el día 15 frente al 30, el día 30 frente al 60 y el día 15 frente al 60. Los resultados se muestran en las tablas 4, 5 y 6, respectivamente. Una vez más, las entradas se seleccionaron sobre la base de fuertes valores p, así como valores d de Cohen que indican un tamaño del efecto en el rango medio a grande.

El menor número de entradas se encuentra en la Tabla 4, al comparar el día 15 con el día 30. Sin embargo, la catecol 2,3-dioxigenasa, que se puede considerar valiosa en la desintoxicación metabólica29, estaba notablemente elevada. Por otro lado, se redujo la (3S)-malil-CoA tioesterasa, lo que puede tener un efecto sobre el ciclo de glioxilato de los microorganismos.

Al comparar el día 15 con los días 30 y 60, un cambio notable es la elevación de la ADN polimerasa propensa a errores, que tiene la capacidad de replicarse a través del daño del ADN30. Como se indicó anteriormente, los niveles de enzimas que se alteran en la lista del Día 30 frente al Día 60, pero que no aparecen en la lista del Día 15 frente al Día 30, pueden deberse a un efecto retardado del consumo de uva.

Finalmente, se investigó una comparación de las vías KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (nivel 3) asociadas con el microbioma para el día 15 frente al 30, el día 30 frente al 60 y el día 15 frente al 60. Los resultados se muestran en las Tablas 7, 8 y 9, respectivamente. Una vez más, las entradas se seleccionaron sobre la base de fuertes valores p, así como valores d de Cohen que indican un tamaño del efecto en el rango medio a grande. Se observó un número relativamente bajo de alteraciones de la ruta.

La comparación del día 30 con el día 15 indica una mejora de las "péptidos de cisteína" que desempeñan un papel clave en la hidrólisis de la hemoglobina, la invasión y salida de células sanguíneas y el procesamiento de proteínas de superficie31, "transportadores ABC" mejorados y reducidos, que participan en el movimiento de metabolitos hacia el superficie celular32, y reducción de la "Familia Narl", que es una vía de transducción sensorial33.

Al comparar el día 60 con el día 30, se revela un aumento de las "oxidorreductasas" (una gran clase de enzimas que catalizan la transferencia de electrones34), "transportadores ABC", "péptido sintetasa no ribosómico (NRPS)" (catalizan la síntesis de productos peptídicos importantes a partir de una variedad de y sustratos de aminoácidos no proteinogénicos35) y "peptidasas aspárticas" (importantes procesos metabólicos en microorganismos36).

En la comparación del día 60 frente al día 15, las "vías ABC" se reducen de nuevo, y se conserva la potenciación de "NRPS" y "oxidorreductasas". La alteración más destacada encontrada en todo este conjunto de datos es la mejora del "fotosistema anoxigénico" en este período de tiempo. Esto es algo sorprendente dado que se sabe que las bacterias fototróficas anoxigénicas crecen utilizando la energía de la luz sin desarrollar oxígeno. Sin embargo, se sabe que algunos organismos crecen aeróbicamente en la oscuridad y realizan la biorremediación de tintes recalcitrantes, pesticidas y metales pesados ​​en condiciones anaeróbicas37.

El gráfico de puntuaciones de PLS-DA para el día 15 frente al día 30 se muestra en la figura 2A. Como puede verse, hay muy poca diferencia entre las puntuaciones de los plasmas del día 15 (verde) y del día 30 (azul), con una tendencia del día 30 a moverse hacia el cuadrante superior derecho. El gráfico de puntuaciones de OPLS-DA para el día 15 frente al día 30 se muestra en la figura 2B. Aquí, hay una ligera tendencia a que las muestras del día 15 se agrupen a la izquierda y las muestras del día 30 a la derecha. Sin embargo, claramente no hay separación entre los dos puntos de tiempo.

(A) Gráfica de puntajes de PLS-DA para plasma del día 15 (verde) versus plasma del día 30 (azul), (B) Gráfica de puntajes de OPLS-DA para plasma del día 15 (verde) versus plasma del día 30 (azul) y ( C) Diagrama S de las cargas de OPLS-DA para el plasma del día 15 frente al plasma del día 30. 1, ácido esteárico; 2, ácido glucurónico.

El gráfico S de las cargas OPLS-DA muestra la distribución de los 59 metabolitos plasmáticos identificados (Fig. 2C). Todos los metabolitos elevados y deprimidos se examinaron utilizando un análisis univariado por pares para detectar diferencias significativas entre los dos días de estudio. Se encontró que solo dos metabolitos plasmáticos se alteraron de manera estadísticamente significativa entre la dieta restringida (Día 15) y la dieta de uva (Día 30). El ácido esteárico se elevó un 10 % (P < 0,05) y el ácido β-d-glucurónico se redujo un 17 % (p = 0,003) en plasma.

El gráfico de puntuaciones de PLS-DA para el día 30 frente al día 60 se muestra en la Fig. 3A. En comparación con el análisis de los días 15 y 30, existe una separación marginalmente mejor de las puntuaciones entre las muestras del día 30 y las muestras del día 60, con una tendencia del día 30 a la izquierda y del día 60 a la derecha. Cuando se generó un modelo OPLS-DA (Fig. 3B), la separación parecía ligeramente mejor. Esto se reflejó en el gráfico S de las cargas de OPLS-DA (Fig. 3C), donde cuatro metabolitos estaban elevados en el plasma del día 60 y uno deprimido. Curiosamente, tres azúcares aumentaron después de cambiar de la dieta de la uva a la dieta restringida: glucosa (+ 11 %, p = 0,007), manosa (+ 16 %, p = 0,03) y fructosa (+ 17 %, p = 0,008) , junto con ácido 2-hidroxibutanoico (+7%, p = 0,01). Un metabolito se redujo en el plasma después de regresar de la uva a la dieta restringida: ácido láctico (-17 %, p = 0,02).

(A) Gráfico de puntuaciones de PLS-DA para plasma del día 60 (azul) frente a plasma del día 30 (verde); (B) Gráfico de puntuaciones de OPLS-DA para plasma del día 60 (azul) frente al plasma del día 30 (verde); (C) Diagrama S de las cargas de OPLS-DA para el plasma del día 30 frente al plasma del día 60. 1, glucosa; 2, manosa; 3, fructosa; ácido 4, 2-hidroxibutanoico; 5, ácido láctico.

El gráfico de puntuaciones de PLS-DA para la orina del día 15 frente a la orina del día 30 se muestra en la Fig. 4A. En este gráfico de puntuaciones, surge una separación entre las orinas del día 15 y del día 30. Cuando esto se examinó más a fondo usando un modelo OPLS-DA (Fig. 4B), se observó la misma diferencia emergente entre las orinas de dieta restringida y de uva. El gráfico S de las cargas de OPLS-DA (Fig. 4C) reveló cuatro metabolitos urinarios elevados y diez metabolitos disminuidos. Estas diferencias fueron más profundas que las observadas en las muestras de plasma comparativas.

(A) Gráfico de puntuaciones de PLS-DA para la orina del día 15 (verde) frente a la orina del día 30 (azul); (B) Gráfico de puntuaciones de OPLS-DA para la orina del día 15 (verde) frente a la orina del día 30 (azul); (C) Diagrama S de las cargas de OPLS-DA para la orina del día 15 frente a la orina del día 30. 1, ácido tartárico; ácido 2, 2′-desoxirribonico; 3, ácido glutacónico; ácido 4, 3-hidroxifenilacético; 5, Valina; ácido 6, 3-indolacético; 7, ribosa; ácido 8, 2,3-dihidroxibutanoico; 9, galactosa; 10, glucosa; 11, ácido hipúrico; 12, ácido carbámico; 13, ácido malónico; 14, levoglucosano.

El gráfico de puntuaciones de PLS-DA para la orina del día 30 frente a la orina del día 60 se muestra en la Fig. 5A. Las orinas de dieta restringida y de uva se separan casi por completo en el gráfico de puntuaciones de PLS-DA, y se observó una mejora continua cuando se aplicó el modelo OPLS-DA (Fig. 5B). Como se muestra en el gráfico S de las cargas de OPLS-DA (Fig. 5C), un metabolito urinario se elevó al regresar a la dieta restringida y cinco metabolitos disminuyeron.

Gráfico de puntuaciones de PLS-DA para la orina del día 30 (verde) frente a la orina del día 60 (azul) (A); Gráfico de puntuaciones de OPLS-DA para la orina del día 30 (verde) frente a la orina del día 60 (azul) (B); Cargas OPLS-DA S-plot para la orina del día 30 frente a la orina del día 60. 1, ácido tartárico; ácido 2, 2′-desoxirribonico; 3, ácido glutacónico; 4, ácido ribónico; ácido 5, 3-hidroxifenilacético; 6, ácido fumárico (C).

Por último, pensamos que sería interesante segregar un grupo de sujetos que mostraran los cambios de perfil únicos más obvios según el género y la especie bacterianos, y comparar estos sujetos con el resto de la población de estudio. En consecuencia, se seleccionaron 11 sujetos que demostraron los cambios de perfil que se muestran en la Fig. 6.

Selección arbitraria de 11 sujetos basada en cambios de perfil únicos de género (A) y especie (B).

Como era de esperar, según el método de selección de estos 11 sujetos, la comparación de la diversidad alfa (Suplemento 1, Fig. S1D) y la diversidad beta (Suplemento 2, Fig. S1D) con los 18 sujetos restantes no reveló diferencias significativas. Sin embargo, como se resume en el Suplemento 3, la comparación del Día 15 frente al Día 30, y el Día 15 frente al Día 60, de estos 11 sujetos con los 18 sujetos restantes, reveló diferencias significativas en términos de comparaciones taxonómicas, enzimáticas y de la vía KEGG. Por ejemplo, en la comparación de 15 frente a 60 días, se alteró la abundancia de Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae y Ruminococcus (Suplemento 3, Tabla S1), al igual que tres vías KEGG (Suplemento 3, Tabla S2) y 13 enzimas ( Suplemento 3, Tabla S3).

La comparación del día 30 frente al día 60 (Suplemento 3, Tabla S4) reveló que los siguientes taxones son significativamente diferentes: clase: Coriobacteriia (metabolismo de ácidos biliares38), orden: Coriobacteriales (metabolismo de ácidos biliares39), familia: Coriobacteriaceae (metabolismo de ácidos biliares40), género: Collinsella (Collinsella se ha relacionado con la disbiosis proinflamatoria en la diabetes tipo 2 y con insulina circulante que sugiere un mecanismo para promover la patología NAFLD41), especie: Collinsella aerofaciens (C. aerofaciens es el principal usuario de lactosa en el colon humano Varios estudios demostraron que Collinsella y Bifidobacterium pueden modificar los ácidos biliares del huésped para modular la virulencia y patogenicidad de los patógenos entéricos42). En consecuencia, se observaron varias diferencias significativas en las comparaciones de enzimas y vías KEGG del día 30 frente al día 60 (suplemento 3, tablas S6 y S7).

La brecha en la variación de la abundancia taxonómica fue menos profunda en la comparación del día 15 frente al día 60 de los sujetos seleccionados con el resto del grupo (Suplemento 3, Tabla S7). Sin embargo, se observaron muchas diferencias significativas en los niveles de enzimas (Suplemento 3, Tabla S8) y vías KEGG (Suplemento 3, Tabla S9).

Finalmente, se investigaron los análisis metabolómicos comparativos de los dos subgrupos con OPLS-DA en el punto de tiempo del día 30 (después del consumo de uva). Como se muestra en la Fig. 7, el grupo seleccionado de 11 sujetos se puede distinguir de los 18 sujetos restantes sobre la base de los gráficos de puntuaciones OPLS-DA, con muestras de orina y plasma. Sin embargo, los análisis de datos univariados de los metabolitos urinarios y plasmáticos que se consideró que se originaron en la microbiota no mostraron una gran diferencia entre los dos grupos, aparte del mioinositol en plasma, que disminuyó un poco (p = 0,03) (Suplemento 4).

Gráficos de puntajes OPLS-DA de muestra de plasma del grupo seleccionado de 11 sujetos (rojo) frente a los 18 sujetos restantes (verde) determinados con muestras de plasma (A) y orina (B).

Mientras que el microbioma intestinal de un individuo sano es relativamente estable, la disbiosis puede provocar o estar asociada con problemas de salud como la enfermedad de Crohn, enfermedades autoinmunes, cáncer de colon, úlceras gástricas, enfermedades cardiovasculares y obesidad. En el presente estudio, los sujetos humanos variaron según el género y la edad, pero se consideró que todos gozaban de buena salud. Por lo tanto, se esperaba que estos individuos comenzaran el estudio en un estado eubiótico, es decir, con un equilibrio entre bacterias beneficiosas y dañinas. Por lo tanto, nuestro objetivo no estaba orientado a inducir ninguna alteración en particular. Nuestro objetivo era simplemente determinar si el consumo de una fruta dietética común, es decir, la uva, funcionaba como prebiótico, probiótico o antibiótico o, de hecho, no provocaba ningún cambio importante. Al hacerlo, después de un período de dos semanas con un régimen dietético controlado, la dieta se complementó durante un período de dos semanas en el que se consumió diariamente un sustituto de uva bien definido equivalente a tres porciones normales y, finalmente, una Período de lavado de un mes en el que se continuó con el régimen dietético controlado pero se interrumpió la suplementación con uva. Se recogieron muestras fecales para su análisis en cada uno de estos tres puntos temporales.

Primero examinamos la diversidad alfa como una indicación amplia de la riqueza (número) o la uniformidad (abundancia relativa) de toda la población de estudio. No hubo diferencias perceptibles entre las poblaciones en los días 15, 30 o 60 (Suplemento 1, Fig. S1A). Dado que la diversidad alfa puede variar con el género y la edad43, segregamos a nuestros sujetos en cohortes y repetimos el análisis. Una vez más, no se observaron diferencias importantes en los diversos puntos temporales, aparte de las mujeres, de 29 a 39 años de edad, al comparar la línea de base con el día 30 (15 días de consumo de uvas) donde el valor D de Cohen para la prueba de Chao fue 0,836 y el valor de p fue 0,114 (prueba t de Student pareada), y comparando la línea base (día 15) con el período de lavado (día 60), donde el valor D de Cohen fue 0,982 con un valor de p correspondiente de 0,079 (Suplemento 1, Fig. .S1B). Esta diferencia no se observó con sujetos masculinos (Suplemento 1, Fig. S1C), ni hubo diferencia al comparar el día 30 y el día 60 del grupo femenino (prueba de Chao; valor D de Cohen 0.047 y p = 0.93, t de Student pareada). prueba).

Es interesante que la diversidad alfa de las hembras que mostraron un cambio después del consumo de uva no volvió a la línea de base después del período de lavado de 30 días. Las ramificaciones de este cambio, si las hay, merecen una mayor investigación. Observamos que Yang et al.15 informaron un cambio significativo en el índice de Shannon cuando a 19 sujetos humanos se les proporcionó el sustituto de uva utilizado en este documento durante un período de 4 semanas. No se especificó el sexo de los sujetos inscritos en este estudio, aunque se indicó que el rango de edad era de 18 a 55 años y se excluyeron las mujeres posmenopáusicas. También observamos que una mayor calidad de la dieta puede reflejarse en una mayor diversidad de microbiota intestinal44, como se observó en el grupo de mujeres de nuestro estudio.

A continuación, investigamos la diversidad beta, la similitud o la diferencia, en los días 15, 30 y 60. La diferencia de Bray-Curtis se calculó y visualizó a través de PCA y PCoA. Como se ilustra en el Suplemento 2, no se observaron diferencias importantes con la población de estudio antes, durante o después del consumo de uva. Esto fue cierto para la población de estudio en su conjunto, así como para las subdivisiones basadas en el género.

Por lo tanto, con base en los análisis de diversidad alfa y beta, concluimos que el consumo de uva per se no altera las relaciones comunales generales de la microbiota con esta población de estudio. A diferencia de los estudios in vitro o con animales controlados, existe una variación significativa entre individuos cuando se examinan seres humanos de vida libre. Esto se ilustra mediante la comparación de la primera de las barras triples que se muestran en la figura 1A (día 15) y las superposiciones compuestas que se ilustran en la figura 1B. Después del período de intervención de la uva (Día 30), la comparación de las dos primeras barras de la Fig. 1A (Día 15 frente a Día 30) sugiere cambios en prácticamente todos los casos, como se puede visualizar aún más mediante la comparación de las superposiciones compuestas de los correspondientes días (Fig. 1B). Según el diseño del estudio, el factor más probable que condujo a estos cambios fue la administración dietética de uvas durante 2 semanas. Las barras finales de los tripletes ilustran el estado de la microbiota después de la terminación de la administración de uvas, al igual que la tercera superposición. La pregunta abordada por este último punto de tiempo fue si el patrón volvería a la administración anterior de la uva o si se perpetuarían los cambios. La respuesta parece residir en el individuo.

En primer lugar, está claro que la abundancia de componentes de la microbiota, de hecho, cambia con la intervención de la uva en la dieta, como se puede percibir a partir de las superposiciones compuestas en los distintos puntos temporales (Suplemento 3, Fig. S1). Existen diferencias entre los tres puntos de tiempo. En la figura 6 se ilustra un examen más granular con sujetos seleccionados. Lo que podemos deducir de estos ejemplos es que un cambio en el microbioma inducido por el consumo de uva puede ser duradero, como lo muestran los sujetos 1, 9 y 13, puede volver a la línea de base de 15 días, como la muestran los sujetos 21 y 32, no muestra ningún cambio manifiesto (sujetos 3 y 28), o algo intermedio.

Los análisis comparativos de la taxonomía de toda la población del estudio indicaron cambios significativos en la abundancia microbiana al comparar el día 15 con el día 30 (Tabla 1), el día 30 con el día 60 (Tabla 2) y el día 15 con el día 30 (Tabla 3). ). Los cambios correspondientes en los niveles de enzimas (Tablas 4, 5, 6) y las vías KEGG (Tablas 7, 8, 9) se asociaron con los cambios taxonómicos en cada comparación de tiempo. Como un intento de descifrar las consecuencias fisiológicas de estos efectos, se realizaron análisis metabolómicos con muestras de plasma y orina proporcionadas por la población de sujetos en cada momento para la investigación de los metabolitos que se consideraban asociados con el microbioma.

Con plasma, el gráfico de puntuaciones de PLS-DA para el día 15 frente al día 30 mostró poca diferencia (Fig. 2A). De manera similar, el gráfico de puntajes OPLS-DA no reveló una separación clara entre los dos puntos de tiempo (Fig. 2B). De acuerdo con esto, el gráfico S de las cargas OPLS-DA mostró la distribución de los 59 metabolitos plasmáticos identificados (Fig. 2C), pero solo dos [ácido esteárico elevado 10% (P < 0.05) y ácido β-d-glucurónico deprimido 17 % (p = 0,003)] mostró cambios estadísticamente significativos.

Al comparar el día 30 con el día 60, en relación con la comparación del día 15 con el día 30, se observó una separación marginalmente mejor en el gráfico de puntuaciones de PLS-DA (Fig. 3A), que mejoró un poco con la generación de un modelo OPLS-DA (Figura 3B). Como se refleja en el gráfico S de las cargas de OPLS-DA (Fig. 3C), se elevaron tres azúcares después de cambiar de la dieta de uva a la dieta restringida [glucosa (+ 11 %, p = 0,007), manosa (+ 16 %, p = 0,03) y fructosa (+ 17 %, p = 0,008)], junto con ácido 2-hidroxibutanoico (+ 7 %, p = 0,01). El ácido láctico se redujo en plasma después de regresar de la uva a la dieta restringida (-17%, p = 0,02).

El aumento de glucosa, manosa y fructosa después del cese de la uva durante el período de lavado después del cese de la uva se correlaciona con el potencial del consumo de uva para ser beneficioso en el síndrome metabólico, como se informa en la literatura45,46. De acuerdo con esta sugerencia, hemos informado que la adición de uvas tanto a una dieta estándar como a una dieta alta en grasas en ratones se asocia con una regulación positiva de la lanzadera de malato-aspartato y, por lo tanto, la eficiencia de la utilización de glucosa por parte del hígado12. Además, el ácido 2-hidroxibutanoico se produce principalmente en el hígado durante la síntesis de glutatión, que también hemos informado que está elevada en relación con una dieta de uva en ratones6.

El análisis de la orina recolectada durante un período de 24 h reveló diferencias más llamativas al comparar los puntos de tiempo de toda la población de sujetos. La clara separación de la orina del día 15 frente a la orina del día 30 se ilustra mediante el gráfico de puntuaciones PLS-DA (Fig. 4A) y el modelo OPLS-DA (Fig. 4B). El gráfico S de las cargas OPLS-DA (Fig. 4C) reveló cuatro metabolitos urinarios elevados, cuya mejora se consideró un resultado directo del consumo de uvas, ya que todos se redujeron después de 30 días adicionales con una dieta libre de uvas.

El ácido tartárico se incrementó más profundamente (cinco veces, p < 0,0001). Como componente de la uva en sí, esto puede verse como un buen indicador para monitorear el consumo de uva o el cumplimiento de la dieta. También elevado por el consumo de la dieta de la uva fue el ácido 2'-desoxirribonico (+ 26%, P = 0,009). Este metabolito se deriva de la hidrólisis de 2′-desoxirribonolactona, que se forma en el ADN por oxidación de 2′-desoxirribosa en sitios abásicos, ocurriendo la lesión de ADN más frecuente a razón de miles por célula por día. Este proceso ocurre preferentemente en los sitios de replicación del ADN donde la hebra simple de ADN rezagada es más vulnerable, particularmente a la depuración47. La 2′-desoxirribonolactona se libera a partir del ADN dúplex con una vida media de 32 a 54 h, pero se libera más rápido a partir del ADN monocatenario con una vida media de aproximadamente 20 h48. Por lo tanto, la elevación del ácido 2'-desoxirribonico después del consumo de uva puede ser una acumulación de eventos que ocurren durante muchos días anteriores. También es posible que este proceso represente la depuración natural del ADN cuya reparación se ve reforzada por uno o más constituyentes de la uva. Además, en dos investigaciones previamente informadas sobre la administración de uvas a ratones, también observamos elevaciones de ácido 2′-desoxirribonico que se asociaron con la administración de una dieta con uvas6,12, y se observaron variaciones interindividuales en estudios de intervención en humanos49.

Además, el ácido glutacónico, otro compuesto de 5 carbonos derivado del glutamato, también se encontró elevado después del consumo de uva (+ 26 %, p = 0,004). El ácido 3-hidroxifenilacético, relacionado con el metabolismo de la tirosina, también estaba elevado (+44%, p = 0,002). Por otro lado, se vio disminuida la excreción urinaria de dos sustancias relacionadas con el metabolismo de la microbiota intestinal, el ácido 3-indolacético y el ácido hipúrico, así como valina, ribosa, ácido 2,3-dihidroxibutanoico, galactosa, glucosa, ácido carbámico, ácido malónico. y levoglucosano.

Una revisión de la literatura reveló que el origen bacteriano del ácido glutacónico involucra a Clostridium symbiosum50 y el origen bacteriano del ácido 3-hidroxifenilacético involucra a Parabacteroides spp.51, Clostridia spp.52 o Klebsiella pneumoniae53. Estas especies no están incluidas en la Tabla 1 que resume las principales alteraciones taxonómicas y, de hecho, los análisis posteriores revelaron que estas especies no eran significativamente diferentes el Día 15 frente al Día 30 en esta población de estudio (Suplemento 5). Se requiere más trabajo para aclarar tales cuestiones, pero esta dicotomía ilustra el valor de la metabolómica sobre la microbiómica para definir la producción real de metabolitos potencialmente bioactivos.

El análisis del gráfico de puntuaciones de PLS-DA para la orina del día 30 frente a la orina del día 60 (Fig. 5A) y el modelo OPLS-DA (Fig. 5B) mostraron una separación de puntuaciones aún más clara. En el gráfico S de cargas OPLS-DA (Fig. 5C), un metabolito urinario se elevó al regresar a la dieta restringida y, como se señaló anteriormente, los metabolitos luego de la adición de uva a la dieta disminuyeron.

Finalmente, como se mencionó anteriormente y se ilustra en la Fig. 6, está claro que la variación individual se discernirá en un grupo de seres humanos que viven libremente. A los efectos de este estudio, la población de sujetos estuvo de acuerdo con las restricciones dietéticas y de estilo de vida (Suplementos 6 y 7) para que podamos acceder al impacto del consumo de uva con la mayor precisión posible. Esto no quiere decir, sin embargo, que esperáramos que los individuos respondieran de una manera completamente homogénea. En base a estas consideraciones, pensamos que sería de interés segregar un segmento específico de la población de estudio, inicialmente en base a perfiles taxonómicos del microbioma, y ​​comparar este grupo selecto con los demás participantes en el estudio utilizando la misma metodología.

De los 29 participantes que completaron el estudio, se seleccionaron 11 sujetos en función de cambios de perfil únicos de género y especie al comparar los tres puntos temporales (Fig. 6). Al igual que con el grupo en su conjunto, no se encontraron diferencias significativas en la diversidad alfa y beta del microbioma de los 11 sujetos seleccionados. Sin embargo, en cada comparación de tiempo (15 vs. 30; 15 vs. 60; 30 vs. 60), se descubrieron diferencias significativas cuando los 11 sujetos seleccionados se compararon con los 18 sujetos restantes en términos de taxonomía, niveles de enzimas y análisis de la vía KEGG. (Suplemento 3). Confirmando la importancia funcional de estas diferencias, en el punto de tiempo del día 30 (después del consumo de uva), se observó una clara separación usando OPLS-DA, tanto con muestras de plasma (Fig. 7A) como con orina (Fig. 7B). Queda por caracterizar la naturaleza química completa de estos cambios metabólicos. Hasta el momento, nuestro análisis de los metabolitos urinarios y plasmáticos que se considera que se originan en la microbiota solo ha arrojado la identidad del mioinositol en el plasma, que disminuyó un poco (p = 0,03) (Suplemento 4).

En resumen, los datos presentados aquí demuestran que el consumo de uva no perturba el estado eubiótico del microbioma en sujetos humanos normales y sanos. El consumo de uva cambia la composición taxonómica del microbioma, los niveles de enzimas, las vías KEGG y el metaboloma. Como es común en el trabajo que involucra a un grupo heterogéneo de seres humanos de vida libre, la variación interindividual se demostró mediante un subanálisis de la población de estudio. Sin embargo, con el grupo de estudio en su conjunto, se observaron cambios mediados por el consumo de uva que se puede esperar que se apliquen ampliamente. Se requiere más investigación para determinar si estas respuestas son responsables o están relacionadas con alguno de los beneficios para la salud que se han asociado con las uvas, aunque parece lógico esperar que los cambios de este tipo sean lo suficientemente profundos como para tener importancia.

El objetivo de este estudio fue determinar el efecto potencial del consumo de uva en el microbioma, basado en la composición microbiana del microbioma y análisis metabolómicos. Como un intento de eliminar tantos factores de confusión como fuera posible, se solicitó a los sujetos que cumplieran con los Criterios de inclusión/exclusión descritos en el Suplemento 6. Con los sujetos que cumplían los criterios, se discutió la naturaleza general del estudio. En particular, se revisaron las restricciones de dieta y suplementos asociadas con el estudio (descritas en el Suplemento 7), y se proporcionó a los sujetos un número de contacto para hacer cualquier pregunta relacionada con los alimentos permitidos. En este punto, los sujetos que firmaron un documento de consentimiento informado se inscribieron en el estudio.

El día 1 del estudio, a los sujetos se les proporcionó el primer kit de recolección de muestras fecales y comenzaron la dieta del estudio. Se les indicó que recolectaran una muestra fecal el día 13/14 y que devolvieran el kit de prueba que contenía la muestra el día 15 (± 2 días). Además, se indicó a los sujetos que ayunaran durante un período de 12 h antes de devolver la muestra fecal el día 15, ya que el plasma también se prepararía ese día.

En el Día 1 del estudio, a los sujetos también se les proporcionó un recipiente de recolección de orina. Aproximadamente en el día 14 del estudio, cada voluntario recolectó una muestra completa de orina de 0 a 24 horas. Durante el período de recolección en casa, la muestra fue refrigerada entre y después de cada recolección.

El día 15 del estudio, se recibieron los primeros kits de prueba fecal. Todas las muestras fecales se recolectaron, registraron y prepararon para su envío de acuerdo con las pautas de Diversigen. Dentro de las 24 h, las muestras se enviaron a Diversigen (New Brighton, MN) para su análisis por correo urgente.

Además, se recibieron los primeros frascos de muestra de orina y se agitaron a mano para garantizar la homogeneidad. El volumen se midió en ml y se registró. Se transfirieron cinco ml a tubos Falcon de 15 ml, se etiquetaron con el código del sujeto, la fecha y la hora y el volumen de orina de 24 horas, y se congelaron a -20 °C antes del análisis.

A los sujetos se les proporcionó el segundo kit de prueba fecal, un segundo recipiente de recolección de orina y suficiente polvo de uva para durar el período de tiempo de consumo de polvo de uva de dos semanas. Además de proporcionar hojas de instrucciones (Suplemento 8), se instruyó a los sujetos sobre cómo usar el polvo durante el estudio. Justo antes del consumo, los sujetos mezclaron el polvo de uva (36 g) con aproximadamente 6 oz de agua. Esto se hizo dos veces al día (una por la mañana y una por la tarde/noche) durante 14 días. Se aconsejó a los sujetos que si olvidaban una dosis, la tomaran lo antes posible. A los sujetos se les entregó un diario en el que registrar el uso del producto y se les indicó que trajeran las bolsas de polvo vacías para registrar el cumplimiento el día 30 (± 2 días).

Finalmente, se extrajeron al menos 7 ml de sangre completa en un tubo Vacutainer heparinizado de 10 ml (que contenía heparina sódica) y se colocó en hielo hasta la centrifugación a 4 °C durante al menos 15 min a 2200–2500 rpm. Usando una pipeta Pasteur de vidrio (de un solo uso), la capa superior de plasma (3 ml) se retiró con cuidado sin transferir glóbulos rojos y se colocó en un tubo de plástico con tapa de rosca, etiquetado con el código del sujeto, la fecha y la hora. Las muestras se almacenaron a -20 °C antes de los análisis.

El día 30 del estudio, los sujetos devolvieron el segundo kit de prueba fecal que contenía una muestra que se había recolectado en el pasado reciente y una recolección de orina de 24 horas. Las muestras se procesaron y almacenaron como se describe anteriormente. Se devolvieron las bolsas vacías que habían contenido previamente el polvo de uva y se interrogó a los sujetos sobre su experiencia. Se informaron los eventos adversos.

Se recogió sangre entera y se preparó plasma como se ha descrito anteriormente. Antes de cada extracción de sangre, los sujetos confirmaron que habían ayunado durante al menos las últimas 12 h. Los sujetos recibieron el tercer kit de recolección de muestras fecales y el tercer recipiente de recolección de orina, y continuaron con la dieta del estudio sin uvas y el régimen sin drogas durante un período de lavado de cuatro semanas.

El día 60 (± 2 días), los sujetos devolvieron sus muestras finales de heces y orina que se prepararon para el análisis y se recogieron las muestras de plasma finales.

Para asegurar la consistencia y continuidad de la investigación experimental y clínica sobre el potencial biológico y fisiológico de las uvas, se fabrica un polvo liofilizado bajo los auspicios de la Comisión de Uva de Mesa de California (Fresno, CA)54. El polvo de uva, que sirve como sustituto de las uvas frescas, se compone de uvas rojas, verdes y negras frescas con semillas y sin semillas que se muelen y liofilizan para retener sus compuestos bioactivos. El polvo se prepara utilizando buenos procedimientos de fabricación para alimentos. Se proporciona una mayor garantía de calidad al garantizar que el producto esté libre de contaminantes a través de análisis microbianos. Además, el producto está sujeto a estandarización química para la cuantificación de componentes fitoquímicos clave54. Para los estudios actuales, se suministraron paquetes sellados al vacío que contenían 36 g de polvo de uva liofilizado estandarizado y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

Cuarenta y un (41) sujetos se inscribieron en el estudio y 29 sujetos (70,7%) completaron el estudio. Doce (12) sujetos (29,3%) interrumpieron el estudio. Cinco (5) sujetos (12,2 %) retiraron su consentimiento, 3 sujetos (7,3 %) se perdieron durante el seguimiento, 2 sujetos (4,9 %) se debieron a EA (necesidad de medicación de exclusión y síntomas de Covid-19) y 2 sujetos ( el 4,9%) se debieron a Otro (medicamento excluyente y positivo por Covid-19).

La edad media (desviación estándar [SD]) del sujeto fue de 39,8 (9,6) años, donde la mediana de edad fue de 40,0 años y las edades mínima y máxima fueron de 20,9 a 55,7, respectivamente. Veintidós (22) sujetos (53,7%) eran mujeres y 19 sujetos (46,3) eran hombres. La raza del sujeto incluyó Blanco/Caucásico (40 sujetos, 97,6 %) y Otro (1 sujeto, 2,4 %). La mayoría de los sujetos, 29 (70,7 %), no eran hispanos ni latinos y 12 (29,3 %) eran hispanos o latinos.

El protocolo del estudio, la información del sujeto y el formulario de consentimiento informado (ICF) y otra información escrita del sujeto fueron revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) IntegReview, 3815 S. Capital of Texas Hwy, Suite 320, Austin, TX 78,704 , Teléfono: 512–326-3001, Fax: 512–697-0085, http://www.integreview.com.

Toda la investigación se realizó de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes; se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.

Las muestras se extrajeron con PowerSoil Pro (Qiagen) automatizado para un alto rendimiento en el QiaCube HT (Qiagen), utilizando placas Powerbead Pro (Qiagen) con perlas de cerámica de 0,5 mm y 0,1 mm.

Las muestras se cuantificaron con el ensayo Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen).

Las bibliotecas se prepararon con un procedimiento adaptado del kit Illumina DNA Prep (Illumina). Para BoosterShot® (secuenciación superficial, 2 millones de lecturas/muestra), las bibliotecas se secuenciaron en un Illumina NovaSeq utilizando lecturas de 1 × 100 de un solo extremo (Illumina).

Las secuencias de ADN se filtraron por baja calidad (Q-Score < 30) y longitud (< 50), y las secuencias adaptadoras se recortaron usando cutadapt. Las lecturas de la secuencia del huésped humano se eliminaron utilizando Bowtie2.

Las secuencias se recortaron a una longitud máxima de 100 pb antes de la alineación y se convirtieron en un solo fasta usando shi7. Las secuencias de ADN se alinearon con una base de datos seleccionada que contenía genomas representativos en RefSeq para bacterias con cepas adicionales seleccionadas manualmente (Venti). Se realizaron alineaciones con una identidad del 97 % frente a todos los genomas de referencia. Cada secuencia de entrada se comparó con cada secuencia de referencia en la base de datos Venti de Diversigen utilizando una alineación completamente separada con BURST. Los empates se rompieron al minimizar el número total de unidades taxonómicas operativas (OTU) únicas. Para la asignación de taxonomía, a cada secuencia de entrada se le asignó el ancestro común más bajo que era consistente en al menos el 80 % de todas las secuencias de referencia empatadas para el mejor acierto. También se descartaron las muestras con menos de 10.000 secuencias. Se descartaron las OTU que representaban menos de una millonésima parte de todos los marcadores a nivel de especie y aquellas con menos del 0,01 % de sus regiones genómicas únicas cubiertas (y <1 % del genoma completo). El número de conteos para cada OTU se normalizó a la longitud promedio del genoma. Luego, los datos de conteo se convirtieron en abundancia relativa para cada muestra. Las tablas normalizadas y filtradas se utilizaron para todos los análisis posteriores.

Los grupos de ortología de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KO de KEGG) se observaron directamente usando la alineación al 97 % de identidad frente a una base de datos de genes derivada de la base de datos de cepas de Venti. Para construir esta base de datos, se anotó una cepa representativa de cada especie en la base de datos de Venti utilizando Prokka (v 1.12). Las anotaciones de Prokka se referenciaron de forma cruzada con los ID de KEGG, y las secuencias de genes con anotaciones de KEGG se conservaron para su uso en la base de datos funcional. La tabla KO y las tablas posteriores contienen los recuentos KO observados directamente convertidos a abundancia relativa dentro de una muestra. Los KO se colapsaron en vías KEGG de nivel 2 y -3 y módulos KEGG (www.kegg.jp/kegg/kegg1.html).

El índice de Chao1, el índice de Shannon y el recuento de OTU observado (grupo taxonómico) se calcularon utilizando una tabla de taxonomía filtrada y enrarecida establecida en la profundidad mínima permitida para una muestra (10 000) utilizando QIIME 1.9.1. Las métricas de diversidad beta de Bray-Curtis se calcularon a partir de la taxonomía filtrada y la abundancia relativa del módulo KEGG/enzima utilizando QIIME 1.9.1.2.

Primero, se prepararon 24 muestras de control de calidad (QC) agrupando alícuotas de 50 μL de todas las muestras de plasma. Debido a que se iban a realizar múltiples ensayos en cada muestra y para evitar la congelación y descongelación repetitivas, cada muestra se dividió en alícuotas de 200 μL y se almacenó en tubos Eppendorf. Las muestras se etiquetaron como 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C…, donde # = ID del sujeto y A = Día 15 (± 2 días), B = Día 30 (± 2 días) y C = Día 60 (± 2 días). ). Las muestras se almacenaron a -20 °C. Todas las muestras se analizaron por duplicado y junto con las muestras de control de calidad. Estos fueron analizados en siete días consecutivos en lotes de 30 y en un orden que había sido aleatorizado. Por lo tanto, lo más común es que se analizaran duplicados de muestras de plasma en días diferentes. Las muestras se derivatizaron con BSTFA/TMCS y se analizaron con un sistema GC-MS de Agilent utilizando nuestros métodos descritos anteriormente12. Los picos cromatográficos se identificaron utilizando AutoQuant (Agilent) que comparó sus espectros de masas con la biblioteca espectral NIST 14 de 242 466 espectros de masas. En casos de ambigüedad donde los metabolitos relacionados produjeron espectros de masas similares, por ejemplo, los azúcares isoméricos glucosa, galactosa, fructosa y manosa, se emplearon patrones auténticos y se identificaron los picos a partir de sus tiempos de retención en la columna de cromatografía de gases. Algunos componentes produjeron más de un derivado (y por lo tanto un pico cromatográfico), que se sumaron. La concentración relativa de cada metabolito se determinó a partir de la relación entre el área del pico y el área del pico del estándar interno de ácido 4-clorofenilacético. A continuación, se construyó una hoja de cálculo de Excel utilizando Quant Browser que contenía la relación de área máxima (concentración relativa) de todos los metabolitos identificados en todas las muestras. Esta matriz de datos se importó a SIMCA 17 para realizar análisis de datos multivariados.

En primer lugar, debido a su predominio bien establecido en cromatogramas GC-MS de orina derivatizada, la urea se eliminó de todas las muestras de orina mediante incubación con ureasa de Jack bean. Se ha informado que este procedimiento aumenta el número de metabolitos detectados en la orina y reduce su coeficiente de variación55. En todos los demás aspectos, las muestras de orina se analizaron durante siete días consecutivos mediante los mismos procedimientos que las muestras de plasma.

Este análisis también se conoce como proyección a estructuras latentes-análisis discriminante. Es un análisis de datos multivariante supervisado, lo que significa que la clase de cada muestra está incluida en el análisis. PLS-DA y otros métodos supervisados ​​están fácilmente sujetos a un modelado excesivo de los datos. Para interceptar tal sobremodelado, los modelos PLS-DA se sometieron a una metodología de validación utilizando un protocolo de exclusión con 200 permutaciones. La caída de los valores de R2 (correlación) y Q2 (previsibilidad) por debajo de 0,3 y 0, respectivamente, garantiza que los datos no se modelaron en exceso en el análisis PLS-DA.

Este análisis reduce la dimensionalidad de los gráficos de puntuaciones de PLS-DA. Los diagramas S de las cargas OPLS-DA consiguientes muestran los metabolitos determinados por GC-MS en relación con su abundancia relativa (eje X) y su correlación con el modelo OPLS-DA (eje Y). Las cargas en el cuadrante superior derecho representan los metabolitos que están regulados al alza en el grupo de prueba y los del cuadrante inferior izquierdo representan los metabolitos que están regulados a la baja en el grupo de prueba. Las cargas que se extienden a ambos lados del punto gráfico (0,0) representan metabolitos que no están relacionados con la manipulación experimental, por ejemplo, el cambio de dieta.

Después de generar los conjuntos de datos descritos anteriormente, la inspección visual de las parcelas apiladas de especies microbianas mostró algunos cambios de perfil individuales únicos (Figs. 1A y 6A). Esto, en combinación con las mayores diferencias observadas en las coordenadas geométricas de las parcelas PCA [Suplemento 2, Fig. S2 paneles D(i)-D(vi)] condujo a la selección de 11 sujetos (seis mujeres y cinco hombres). Se realizaron subanálisis comparando estos 11 sujetos seleccionados con los 18 sujetos restantes utilizando la misma metodología descrita anteriormente.

Para determinar la significación estadística entre los grupos a lo largo del tiempo, se realizaron pruebas t pareadas utilizando Microsoft Excel. Además, se calcularon los valores d de Cohen (tamaño del efecto) para comparar diferentes grupos56. El análisis de datos univariante (prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon) se realizó utilizando GraphPad Prism 9.3.1 para analizar la metabolómica de GC-MS. La significancia estadística se definió en un nivel de p < 0,05, aunque en algunos casos, se informan valores de p en el rango de 0,05 a 0,10 junto con el tamaño del efecto D de Cohen56. En el texto se incluyen métodos adicionales de análisis estadístico.

Con sujetos que cumplieron con los criterios de inscripción, la naturaleza general de este estudio se discutió en detalle. Esto incluyó restricciones de dieta y suplementos asociadas con el estudio. A los sujetos se les dio un número de contacto para hacer cualquier pregunta. Solo los sujetos que firmaron un documento de consentimiento informado se inscribieron en el estudio.

El protocolo del estudio, la información del sujeto y el formulario de consentimiento informado (ICF) y otra información escrita del sujeto fueron revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) IntegReview, 3815 S. Capital of Texas Hwy, Suite 320, Austin, TX 78704 , Teléfono: 512-326-3001, Fax: 512-697-0085, http://www.integreview.com.

Toda la investigación se realizó de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes; se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.

Los conjuntos de datos generados y analizados para el estudio actual están disponibles en el repositorio del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), número de acceso PRJNA882649.

Enciclopedia de Kioto de genes y genomas

Sintetasa peptídica no ribosómica

Análisis de componentes principales

Análisis de coordenadas principales

Ácidos grasos de cadena corta

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Los autores agradecen a TKL Research, Inc., 1 Promenade Boulevard, Suite 1201, Fair Lawn, NJ 07410, por administrar el reclutamiento de sujetos y la recolección de muestras clínicas.

Este trabajo fue apoyado en parte por la Comisión de Uva de Mesa de California. El patrocinador no participó: en la preparación del artículo; en en la recopilación, análisis e interpretación de datos; en la redacción del informe; y en la decisión de enviar este artículo para su publicación.

Programa de Inmunología, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Asim dave

Facultad de Farmacia y Ciencias de la Salud, Universidad de Western New England, 1215 Wilbraham Rd., Springfield, MA, 01119, EE. UU.

Director Beyoğlu, Jeffrey R. Idle y John M. Pezzuto

División de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Farmacia y Ciencias de la Salud Arnold & Marie Schwartz, Universidad de Long Island, Brooklyn, NY, 11201, EE. UU.

Parque Eun-Jung

Departamento de Medicina, UMass Chan Medical School—Baystate, Springfield, MA, 01199, EE. UU.

Juan M. Pezzuto

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Conceptualización, AD, E.-JP, DB, JRI y JMP; metodología, AD, E.-JP, DB, JRI y JMP; software, AD, E.-JP y DB; validación, AD, E.-JP, DB, JRI y JMP; análisis formal, AD, E.-JP, DB, JRI y JMP; investigación, AD, E.-JP y DB; recursos, JMP y JRI; curación de datos, AD, E.-JP, DB, JRI y JMP; redacción—preparación del borrador original, AD, E.-JP y JMP; redacción—revisión y edición, AD, E.-JP, DB, JRI y JMP; visualización, AD, E.-JP, DB, JRI y JMP; supervisión, E.-JP. JRI y JMP; administración de proyectos, JRI y JMP; adquisición de fondos, JRI, DB y JMP Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a John M. Pezzuto.

JMP es miembro del comité asesor científico de la Comisión de Uva de Mesa de California. Todos los autores restantes declaran que no tienen intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Dave, A., Beyoğlu, D., Park, EJ. et al. Influencia del consumo de uva en el microbioma humano. Informe científico 13, 7706 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34813-5

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Recibido: 22 de septiembre de 2022

Aceptado: 08 mayo 2023

Publicado: 12 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34813-5

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